CÓRDOBA 05.06.09. Base Cero. INTRODUCCIÓN.

Detección e identificación de los anticuerpos eritrocitarios

BASE Cero (Contribución a la actividad de taller, córdoba 05.06.09)

En Inmunohematología los anticuerpos pueden ser clasificados según su naturaleza como de ocurrencia natural o inmune.
La primera actividad (natural) sérica se encuentra sin el conocimiento del huésped (immunitas: libre de obligación), sin la exhibición de un estímulo activo como las transfusiones, gestaciones, o transplantes de células hematopoyéticos.
A su vez los anticuerpos, según la naturaleza del blanco (responsabilidad) pueden clasificarse en Aloinmunes o Autoinmunes; en el primer caso; su efecto biológico lo ejercerá sobre una célula alogenéica (externas), mientras que en siguiente se asociará a células del propio huésped (internas).
La producción múltiple de anticuerpos (sensibilización) y como regla general su especificidad (idiotipo) o su función biológica (isotipo) se hallan en forma normal en un individuo, pero cuando éstos afectan la economía celular del organismo, recortando la sobrevida natural de alguna de las células, estamos en presencia de una patología plausible de análisis desde el laboratorio de inmunohematología.
La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN), reacciones transfusionales por causas inmunológicas (RTIe), las anemias hemolíticas autoinmunes (AHAI), la trombocitopenia aloinmune neonatal (TAIN), la púrpura postransfusional(PPT) o la refractariedad a la transfusión de plaquetas (RTP), la plaquetopenia autoinmune(PTA), y las anemias o trombocitopenias producto del uso de farmacoterapias( AHFI, TFI), son algunos de los eventos clínicos que se estudian en los laboratorios de inmunohematología. Veamos algunas primeras diferenciaciones. Variable: EHRN, RTIe,,AHAI, TAIN, PPT, RTP, PTA, AHFI, TFI. Isotipo hallado: IgG,IgG, IgM,C3-C4,IgG, IgM, C3d, IgG, IgG,IgM, IgG, IgG, C3, IgG. Ejemplo Idiotipo: Rh, ABO, Kell, Dia, ABO, Duffy, Kidd, Rh, Vel, Kell, Rh, I, HI, P, HPA 1ª, HPA 5b, HPA1a, HLA, HPA, ABO, GPIb, IX-V, Dopamina, PF4, Quinidina.

Los anticuerpos son inmunoglobulinas secretadas por los linfocitos B que se diferencian a consecuencia de la estimulación antigénica. Múltiples clones de células B producen al mismo tiempo un universo amplio de anticuerpos (policlonal), esto los hace efectivamente diferentes de los anticuerpos “a medida” (monoclonales) puesto que se obtienen a partir simples clones celulares B y son bioquímicamente idénticos-
Dentro de las pruebas inmunohematológicas que empleamos en el laboratorio de inmunohematología nos proponemos poner en evidencia los isotipos IgG, de las subcategorías capaces de fijar complemento, en mayor medida IgG3, siguiendo la IgG1 y por último la IgG2; y las moléculas IgM que poseen mayor capacidad de fijación de complemento.
La diferencia entre los isotipos radica en el tipo de cadena pesada que conforma la unidad básica; por otra parte, tanto la cadena pesada como liviana de la región variable, configuran la especificidad, donde radica en el sitio de unión al antígeno.
La longitud de la región de bisagra provee a las moléculas de anticuerpos flexibilidad y le confieren mayor o menor capacidad funcional para comenzar el ciclo de destrucción celular.

Distintos factores se deben tener presente a la hora de distinguir la clínica relevancia de los anticuerpos:

1. La especificidad.
2. Concentración y avidez.
3. Amplitud térmica de reacción in vitro.
4. Clase de inmunoglobulina / subclase.
5. Actividad del sistema fagocítico mononuclear del huésped.
6. Densidad y localización antigénica.
7. Volumen de células exógenas al huésped.
8. Presencia de sustancias solubles de grupo sanguíneo.

Dentro de las primeras pruebas que se llevan a cabo se encuentran las de discriminación de la existencia un anticuerpo o varios o la dependencia de un sesgo procedimental (operativo) o las características propias de los especimenes.
El primer interrogante: ¿Hay actividad anticuerpo? debe responderse de inmediato antes de emprender pruebas de mayor coste adicional sin ningún beneficio aparente.
Las respuestas serán tres: a. Hay anticuerpo o anticuerpos b. No hay anticuerpo o anticuerpos detectables c. La reacción no obedece a anticuerpos.
El grado de certeza de la respuesta al primer interrogante dependerá de la sensibilidad analítica del método empleado, la estandarización y la experiencia de uso.

Dentro de las pruebas que nos habilitan la duda de la existencia de un proceso inmune de interés, consideramos las pruebas de compatibilidad transfusional, las pruebas de detección de anticuerpos irregulares, las pruebas de antiglobulina directa, en todos los casos la existencia de un anticuerpo o varios concomitantes podrán manifestarse.


En cualquier caso el primer indicio de la existencia de un anticuerpo libre en el suero de un paciente lo revelamos serológicamente por la aglutinación o hemólisis de las células “blanco” en un medio propicio para la reacción in vitro.
En el caso de las pruebas de detección de anticuerpos, empleamos dos o tres células de donantes de sangre de tipo “O” que se encuentran disponibles comercialmente, las pruebas de detección puede emplear células comerciales en pool por ejemplo R1R1, R2R2 pero sólo en el estrato de DONANTES, y NO PUEDEN ser empleadas en RECEPTORES transfusionales o en estudios en PUÉRPERAS, porque un anticuerpo débil contra un antígeno presente sólo en una de las células podría no producir una reacción detectable.
Entonces, ¿Cuántas más células contenga el set mayor será la capacidad para distinguir anticuerpos?, este interrogante deberá ser respondido por los encargados de la calidad del laboratorio; podrán existir perfiles antigénicos claramente representados en dos, tres o más células, lo importante para la elección del panel es que los antígenos representados se correlacione con los anticuerpos de mayor clínica relevancia y exista la posibilidad de que se expresen en forma potente producto de que la información genética de los donantes contenga doble dosis (homocigoto) por ejemplo en el sistema Rh, Duffy, Kidd, y son propuestos también los de representación zonal por ejemplo el anticuerpo anti-Dia tiene significado clínico en la EHRN, por su frecuencia en nuestra población se hace deseable que se encuentre representado el antígeno en alguna de las células que usamos de screening.
Los eritrocitos se encuentran suspendidos en una solución preservadora, se proporcionan en la concentración adecuada para las pruebas, en el caso de los que se emplean en pruebas en microplaca o gel se halla entre el 0.8 al 1%, y en las pruebas en tubo van de 2 a 4%. Los eritrocitos poseen generalmente una fecha de vencimiento no superior a las 9 semanas a partir de la flebotomía, recordemos al usar paneles de origen europeo, americano o asiático que su simple transporte, tramites y logística local le dará una validez de uso autorizado de no más de tres semanas, de allí se hace recomendable la solicitud de paneles en un plan de entregas para evitar los atrasos y/o entregas muy cercanas a su vencimiento.
El poder antigénico va disminuyendo durante su almacenamiento, esta pérdida podrá ser muy importante en algunos donantes y leve en otros, son variables a controlar : el número de veces que se abra el frasco-gotero, el sostenimiento de una temperatura adecuada 2-6ºC, eliminar del gotero los hematíes antes de dejarlo reposo, homogeneizar adecuadamente (suavemente)el contenido antes de su uso, no adicionar elementos o sustancias ajenas al reactivo, no permitir que sufra cambios bruscos de temperatura (ambiente 18-22ºC), ni caídas, no introducir puntas de pipeta (tips) para tomar su contenido, no cambiar su concentración original.

Autoevaluación Responda verdadero o falso y justifique.
1. ¿La potencia y cantidad de anticuerpos en el suero representa la magnitud clínica del mismo?. Justifique.
2. ¿Podría un panel detector (3) o identificador (16-18) de anticuerpos poseer muchas células y no por ello ser más efectivo? . Justifique.


Los primeros rasgos de las pruebas de detección de anticuerpos permiten identificar el isotipo molecular de los anticuerpos, la amplitud térmica, la fijación de complemento, la velocidad y potencia de asociación, su comportamiento frente a grupos sulfhídricos, y la composición de análisis contra pruebas seriadas de compatibilidad transfusional, dan un panorama de la función biológica, de las características que serán reveladas con las pruebas adicionales de identificación.
La hemólisis o aglutinación deben ser interpretadas como pruebas reactivas, cada método posee una técnica específica para la lectura de los hallazgos, en el blog encuentra los posibles hallazgos inesperados en pruebas en gel sephadex.
Todo el personal que se desempeña en el laboratorio inmunohematológico debe ser capaz de asignarle igual valor en término de cruces de Marsh a las reacciones in vitro, esta uniformidad es más usual en técnicas en gel o microplaca, el uso de microscopía no es obligado, pero en algunos casos donde el hallazgo representa una dificultad interpretativa (rouleaux o campo mixto) el procedimiento es recomendable.
Es necesario emplear controles standards?, es fundamental comprobar que las reacciones se compadecen con el resultado esperado, el uso de controles positivos y negativos certifica al momento de presentar informes que los procedimientos en tanda (corrida) de rutina no poseen gran desviación. Sin embargo no deben confundirse estos controles con los que implican las pruebas de autocontrol, o control de los reactivos o de la prueba SAGH (suero antiglobulina humano).
Las pruebas de autocontrol permiten conocer un rasgo adicional en la actividad del suero y es si éste es capaz de encontrar como blanco sus propias células, en los medios en que hemos ofertado las alogenéicas de Panel. Esto es posible en los hallazgos de autoanticuerpos aunque harán falta pruebas adicionales para corroborar la hipótesis.
Las pruebas de control de reactivos, deben llevarse a cabo sobre todos los lotes(estratos), por fecha, y en forma aleatoria, dándole equiposibiidad a la muestra de ser representativa del conjunto de los reactivos que emplearemos. Para conocer cual es la performance de los mismos deberán existir protocolos de control en los manuales de procedimientos del laboratorio, al momento de darse de alta, comenzar con su uso el reactivo debió pasar la prueba, de no corresponder con las expectativas, de no poseer la calidad exigida por la institución o no reunir las condiciones que explicita el fabricante, deberá tomarse las medidas correspondientes, y no emplear el reactivo como medio diagnóstico.
El control de la prueba SAG consiste en la adición -en las pruebas que han resultado negativas- de células rojas sensibilizadas con IgG en baja concentración para que se combinen con el SAG sobrante, no utilizado, dando como resultado esperado la reactividad.
Es decir, cada vez que una prueba es negativa, tras la lectura del control será reactiva, este ensayo demuestra que durante los diferentes pasos de la prueba incubación-centrifugación-lavados no se ha eliminado, diluido o no agregado el SAG. No controla la calidad del SAGH y no es neceario su uso en técnicas en gel o microplaca, puesto que el reactivo de SAG se halla distribuido en el interior de la columna de gel o dispuesto la fase seca del micropocillo.
Las pruebas cruzadas de compatibilidad(CC) junto a las pruebas de detección de anticuerpos (DAI) suelen reproducir un patrón de interpretación conjunto.


Para ayudar al análisis de la especificidad del o los anticuerpos presentes en el suero de un paciente, podríamos hacer una distinción interpretativa según ciertas variables en los resultados:
Aglutinación en todas las células del Panel: Algunos anticuerpos que aglutinan todas las células puede tener como blanco un antígeno presente en todas las células del panel, y que por su alta concentración no demuestre la diferencia de oferta antigénica de cada donador, un ejemplo de ello es el anticuerpo autólogo anti-I que podrá ligarse a todas las células adultas. La forma de discrimina su especificidad es mediante el uso de células de panel de cordón (recién nacido), o comenzar con diluciones del suero para encontrar las diferencias de aglutinación.
Reacciones de diferente intensidad: Este caso estará indicándonos que existen varios anticuerpos de diferente especificidad, o que la oferta antigénica entre un donante y otro del Panel es diferente, este aspecto se relaciona al modo de herencia genotípica del antígeno y a su condición homo u heterocigoto para el gen que da origen a su posicionamiento en la membrana eritrocitaria.
Reacciones hemólisis: La hemólisis nos correlaciona el hallazgo con anticuerpos capaces de activar complemento in vitro, deberemos observar en que fase de la prueba ocurre.
Cambio en las reacciones por efecto térmico: Los anticuerpos no son termodependientes, pero existe una correlación entre el grado de aglutinación en una escala de tiempo de incubación y el tipo de anticuerpo dependiendo del isotipo, por ejemplo las moléculas IgM logran aglutinar a temperaturas entre 4 a 22 ºC, mientras que la mayoría de los ejemplares IgG lo hace a los 37ºC en el mismo tiempo, esto no implica que un ejemplar anti-D(IgG) no pueda fijarse a 18ºC pero lo hará tras mucho mayor tiempo de incubación.
Uso de reactivos sulfhídricos: El uso de clivantes de la unión disulfuro que ligan las unidades monoméricas de los anticuerpos nos permite reconocer la existencia de una mezcla de isotipos tales como IgM e IgG, para luego identificar el idiotipo presente de cada una. También nos servirán para disociar una aglutinación ocasionada por anticuerpos fríos potentes, y para la destrucción de ciertos antígenos para proseguir con la identificación mediante una interpretación a la inversa de la reacción.
Cambio de la reacción por efecto de enzimas proteolíticas: Los enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas, como catalizadores son sustancias que aceleran la reacción química, la característica sobresaliente para su empleo en el laboratorio de inmunohematología es su elevada especificidad. El sustrato, molécula sobre la que la enzima emplea su acción catalítica, accionará en los dos extremos de la interpretación de las pruebas, desde el debilitamiento de reacciones hasta su fortalecimiento. Los enzimas actúan en puntos clave de pH y temperatura de modo que su empleo deberá contemplar tres variables: • Tiempo de incubación.• pH del medio de reacción. • Temperatura de incubación. Los enzimas que se emplean en inmunohematología poseen diferentes orígenes biológicos: Animal - Vegetal y parasitario. En inmunohematología empleamos al menos 11 diferentes enzimas en forma corriente como la: Tripsina, Popidyl-N-Glycanase, Endo-F, Sialidasa / Neuraminidasa, Ficina Papaína, Pronasa, Pepsina, Endo –b, Proteinasa K y α-Quimiotripsina. Amplíe la información desde aquí: http://inmunohematologia-russo.blogspot.com
Aglutinación en doble población: La existencia de campo mixto en una prueba de identificación de anticuerpos es propia de una carencia de afinidad del anticuerpo por el antígeno, imagínense que la población de cada frasco corresponde a un donante de modo que no hay efectivamente un campo mixto, sin embargo algunos anticuerpos de baja afinidad (autoanticuerpos reaccionando con células alogenéicas) puede dar lugar a la aglutinación de una subpoblación de células de un mismo donante.
Respecto de la titulación: Una elevada semicuantificación relativa de la actividad sérica puede dar lugar a diferentes hipótesis de especificidad, cuando el suero de un individuo es portador de un alto título combinado con la baja avidez puede obedecer a especificidades Ch, Rg, Csa, Yka, Kn, McC, JM, entre otras, de todas formas la hipótesis deberá ser contrastada. También la existencia de múltiples aloanticuerpos puede ser examinada a la luz de diluciones, por ejemplo si portamos una especificidad anti-D de título 1:64 y otra anti-cellano de 1:8, la dilución en tres partes del suero dejará sin efecto la actividad cellano para exhibir sólo la del anti-D

Autoevaluación: Responda verdadero o falso y justifique.
3. La doble población celular no puede presentarse en pruebas de detección de anticuerpos.
4. Los anticuerpos IgG anti-D reaccionan exclusivamente a 37ºC.
5. Las pruebas de titulación también se usan para la identificación del anticuerpo.
6. Los anticuerpos de baja potencia (débiles) poseen bajo título.
7. Los autoanticuerpos anti-I suelen presentar aglutinatos variables en todas las células del panel.
8. El uso de enzimas proteolíticas permitirá la exclusión de aglutinaciones igual que los grupos sulfhídricos.
9. ¿Qué conclusión saca del panel detector de anticuerpo exhibido?
10. ¿Qué anticuerpos quedan excluidos e incluidos a partir del panel identificador?